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1、急性抗凝血類殺鼠劑中毒事件衛(wèi)生應(yīng)急處置技術(shù)方案 急性抗凝血類殺鼠劑中毒事件衛(wèi)生應(yīng)急處置技術(shù)方案 抗凝血類殺鼠劑主要包括香豆素類和茚滿二酮類兩大類，前者如溴敵隆、殺鼠靈、殺鼠醚、殺它仗等，后者有敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮等。急性抗凝血類殺鼠劑中毒是指短期內(nèi)接觸抗凝血類殺鼠劑后引起的以凝血功能障礙為主的全身性疾病。1 概述 1 概述 抗凝血類殺鼠劑多數(shù)為黃色/白色粉末或結(jié)晶，難溶于水，可溶于丙酮、乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，化學(xué)性質(zhì)大多穩(wěn)定。抗凝血類殺鼠劑大多為高毒或劇毒化學(xué)物（附件 1）。抗凝血類殺鼠劑中毒途徑主要為經(jīng)口攝入，絕大多數(shù)為食源性中毒，如食用抗凝血類殺鼠劑污染的食品和飲料，偶見于鼠藥的生產(chǎn)和分裝2、。2 中毒事件的調(diào)查和處理 2 中毒事件的調(diào)查和處理 2.1 現(xiàn)場處置人員的個體防護(hù) 2.1 現(xiàn)場處置人員的個體防護(hù) 現(xiàn)場調(diào)查人員進(jìn)入殺鼠劑生產(chǎn)、儲存現(xiàn)場調(diào)查時(shí)，必須穿戴防顆粒物口罩、工作服、乳膠手套或化學(xué)防護(hù)手套。現(xiàn)場采樣人員采集食品樣品時(shí)，需要穿戴防顆粒物口罩、工作服、乳膠手套或化學(xué)防護(hù)手套。醫(yī)療救護(hù)人員在救護(hù)中毒病人時(shí)，一般不必穿戴防護(hù)裝備。2.2 中毒事件的調(diào)查 2.2 中毒事件的調(diào)查 調(diào)查人員到達(dá)中毒現(xiàn)場后，應(yīng)先了解中毒事件概況，然后進(jìn)行中毒事件相關(guān)場所、人員等調(diào)查工作，并及時(shí)向中毒事件指揮部提出收集并封存所有可疑中毒食品、其他可能導(dǎo)致本次中毒事件物品的建議。2.2.1 中毒事件相關(guān)3、場所的調(diào)查 2.2.1 中毒事件相關(guān)場所的調(diào)查 生活性中毒事件的調(diào)查對象包括中毒事件涉及的食品生產(chǎn)、加工 1至食用整個過程的各個場所，調(diào)查內(nèi)容包括食品加工過程（包括使用的原料和配料、調(diào)料、食品容器、使用的工具），食品的分裝、儲存的條件等。生產(chǎn)性中毒事件的調(diào)查對象主要為生產(chǎn)、儲存場所，調(diào)查內(nèi)容包括生產(chǎn)工藝流程、環(huán)境狀況、通風(fēng)措施、防護(hù)條件、人員接觸情況等。2.2.2 中毒事件相關(guān)人員的調(diào)查 2.2.2 中毒事件相關(guān)人員的調(diào)查 調(diào)查對象應(yīng)包括中毒病人、目擊證人以及其他相關(guān)人員（如飯店負(fù)責(zé)人、廚師、服務(wù)員、食品采購員、同工作場所工人等）。調(diào)查內(nèi)容包括接觸時(shí)間、接觸物質(zhì)、接觸人數(shù)、中毒人數(shù)、中毒的主要4、癥狀、中毒事件的進(jìn)展情況、已經(jīng)采取的緊急措施、飲食的加工方法、食品的來源等。同時(shí)，還應(yīng)向臨床救治單位進(jìn)一步了解相關(guān)資料（如搶救過程、臨床治療資料、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等）。2.2.3 現(xiàn)場周圍環(huán)境和生活習(xí)慣的調(diào)查 2.2.3 現(xiàn)場周圍環(huán)境和生活習(xí)慣的調(diào)查 如某一地區(qū)反復(fù)出現(xiàn)此類事件，則調(diào)查內(nèi)容還應(yīng)包括現(xiàn)場周圍是否同時(shí)有動物大量死亡，動物死前的癥狀表現(xiàn)，現(xiàn)場周圍鼠藥使用情況（包括鼠藥的種類、投放時(shí)間和數(shù)量、儲存等），居民的生產(chǎn)、生活習(xí)慣（如飲水、飲食等）。對現(xiàn)場調(diào)查的資料作好記錄，進(jìn)行現(xiàn)場拍照、錄音等。取證材料要有被調(diào)查人的簽字。2.3 現(xiàn)場中毒樣品的快速檢測 2.3 現(xiàn)場中毒樣品的快速檢測 中毒事件5、現(xiàn)場采集的可疑中毒食物、水、毒餌、鼠藥以及中毒病人的嘔吐物等樣品可在現(xiàn)場進(jìn)行快速定性檢測。主要的香豆素類和茚滿二酮類抗凝血?dú)⑹髣┑姆诸惣胺€(wěn)定性見下表。測定毒餌、鼠藥中的其他香豆素類和茚滿二酮類抗凝血?dú)⑹髣ㄗh使用薄層色譜法進(jìn)行定性測定（附件 2 和附件 3）。考慮敵鼠鈉中毒時(shí)，可使用硫酸鐵試紙目視比色法定性測定（附件 4）。22.4 中毒事件的確認(rèn)和鑒別 2.4 中毒事件的確認(rèn)和鑒別 2.4.1 中毒事件的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn) 2.4.1 中毒事件的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn) 同時(shí)具有以下三點(diǎn)，可確認(rèn)為急性抗凝血類殺鼠劑中毒事件：a)中毒病人有抗凝血類殺鼠劑接觸機(jī)會；b)中毒病人出現(xiàn)以凝血功能障礙為主的臨床表現(xiàn)；c)血液6、嘔吐物和食物等樣品中檢出抗凝血類殺鼠劑。2.4.2 中毒事件的鑒別 2.4.2 中毒事件的鑒別 急性抗凝血類殺鼠劑群體性中毒事件通常容易確認(rèn)，在數(shù)天內(nèi)出現(xiàn)多名相互關(guān)聯(lián)的凝血功能障礙病人時(shí)應(yīng)注意考慮此類事件的發(fā)生。2.5 現(xiàn)場醫(yī)療救援 2.5 現(xiàn)場醫(yī)療救援 急性抗凝血類殺鼠劑中毒后有較長的潛伏期，通常不需要在現(xiàn)場進(jìn)行特殊處理。如病人出現(xiàn)大量嘔血或咯血，應(yīng)注意保持呼吸道通暢，建立靜脈通道，維持生命體征穩(wěn)定。中毒病人應(yīng)就近轉(zhuǎn)送至綜合醫(yī)院觀察和治療。3 中毒樣品的采集與檢測 3 中毒樣品的采集與檢測 3.1 采集樣品的選擇 3.1 采集樣品的選擇 可能導(dǎo)致中毒的食物、中毒病人的嘔吐物、胃內(nèi)容物和血液7、是首選樣品。另外，可根據(jù)中毒事件的流行病學(xué)特點(diǎn)和衛(wèi)生學(xué)調(diào)查結(jié)果，初步確定還應(yīng)采集的其它樣品種類。3.2 樣品的采集方法 3.2 樣品的采集方法 嘔吐物、胃內(nèi)容物、固體食品和半流質(zhì)食品使用具塞玻璃瓶或聚乙烯瓶密閉盛放，采樣量 50g100g；液體樣品(血液除外)使用具塞玻璃瓶或聚乙烯瓶盛放，采樣量 300ml500ml；血液樣品使用具塞的抗凝試管盛放，采血量應(yīng)大于 10ml。3.3 樣品的保存和運(yùn)輸 3.3 樣品的保存和運(yùn)輸 所有樣品采集后最好在 4條件下冷藏保存和運(yùn)輸，如無條件冷藏 3保存運(yùn)輸，樣品應(yīng)在采集后 24h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測。所有實(shí)驗(yàn)室檢測完畢的樣品，應(yīng)在冷凍條件下保存一周，以備實(shí)驗(yàn)8、室復(fù)核。3.4 推薦的實(shí)驗(yàn)室檢測方法 3.4 推薦的實(shí)驗(yàn)室檢測方法 3.4.1 血液、尿液和動物組織中香豆素類和茚滿二酮類抗凝血類鼠藥的定性、定量測定高效液相色譜紫外法（附件 5）。3.4.2 血液、尿液和動物組織中香豆素類和茚滿二酮類抗凝血類鼠藥的定性、定量（確證）測定高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（附件 6）。4 醫(yī)院內(nèi)的救治 4 醫(yī)院內(nèi)的救治 4.1 病人交接 4.1 病人交接 中毒病人送到醫(yī)院后，由接收醫(yī)院的接診醫(yī)護(hù)人員與轉(zhuǎn)送人員對中毒病人的相關(guān)信息進(jìn)行交接，并簽字確認(rèn)。4.2 診斷和診斷分級 4.2 診斷和診斷分級 救治醫(yī)生向中毒病人或陪護(hù)人員詢問病史，對中毒病人進(jìn)行體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查，確9、認(rèn)中毒病人的診斷，并進(jìn)行診斷分級。診斷分級 診斷分級 a)觀察對象 a)觀察對象 有抗凝血類殺鼠劑接觸機(jī)會，而無臨床癥狀者。b)輕度中毒：出現(xiàn)鼻衄、牙齦出血、皮膚瘀斑及紫癜等癥狀。c)中度中毒：在輕度中毒基礎(chǔ)上，具有下列之一者：i 血尿；ii 便血；iii 陰道出血；iv 球結(jié)膜出血。d)重度中毒：出現(xiàn)下列之一者：i 消化道大出血；4 5ii 顱內(nèi)出血；iii 咯血。4.3 治療 4.3 治療 接收醫(yī)院對所接收的中毒病人確認(rèn)診斷和進(jìn)行診斷分級后，根據(jù)病情的嚴(yán)重程度將病人送往不同科室進(jìn)行進(jìn)一步救治。觀察對象應(yīng)進(jìn)行至少 1 周醫(yī)學(xué)觀察，輕、中度中毒病人住院治療，重度中毒病人立即監(jiān)護(hù)搶救治療，重點(diǎn)監(jiān)10、測凝血功能指標(biāo)變化。4.3.1 清除體內(nèi)毒物 4.3.1 清除體內(nèi)毒物 意識清晰者，早期可進(jìn)行催吐。對經(jīng)口中毒不足 6h 的病人應(yīng)進(jìn)行洗胃。4.3.2 特效解毒藥物 4.3.2 特效解毒藥物 維生素K1為抗凝血類殺鼠劑的特效解毒劑，需早期、足量應(yīng)用。輕、中度中毒病人每次 10mg20mg，肌內(nèi)注射或靜脈注射，每日 24 次；重度中毒病人每次 20mg40mg，靜脈注射，每日 34 次。在給予特效解毒劑期間，應(yīng)密切監(jiān)測中毒病人的凝血酶原時(shí)間。在凝血酶原時(shí)間恢復(fù)正常后，維生素K1逐漸減量，停藥后定期復(fù)查凝血酶原時(shí)間。4.3.3 其他止血措施 4.3.3 其他止血措施 重度中毒病人可予以新鮮血漿、凝11、血酶原復(fù)合物或凝血因子以迅速止血，并可早期、足量、短程給予腎上腺糖皮質(zhì)激素。4.3.4 其他對癥支持治療 4.3.4 其他對癥支持治療 加強(qiáng)營養(yǎng)、合理膳食，注意水、電解質(zhì)及酸堿平衡，密切監(jiān)護(hù)心、腦、肝、腎等重要臟器功能，及時(shí)給予相應(yīng)的治療措施。5 應(yīng)急反應(yīng)的終止 5 應(yīng)急反應(yīng)的終止 中毒食品和其他可疑毒物已經(jīng)完全收繳和銷毀，中毒相關(guān)危險(xiǎn)因素已被有效控制，未出現(xiàn)新的中毒病人且原有病人病情穩(wěn)定 24h 以上。6附件 1:附件 1:抗凝血類殺鼠劑的理化性質(zhì)和毒性 抗凝血類殺鼠劑的理化性質(zhì)和毒性 毒性 毒性 毒物名稱毒物名稱CAS CAS 分子式 分子式 物理特性 物理特性 化學(xué)性質(zhì) 化學(xué)性質(zhì) 動物動12、物途徑途徑LDLD5050（mg/kg）（mg/kg）備注 備注 溴敵隆 28772-56-7 C30H22O3Br白色或微黃色粉末，難溶于水，可溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，但在高濕度時(shí)暴露在陽光下可分解。大鼠 經(jīng)口1.1 有二次中毒的可能 溴鼠靈 56073-10-0 C31H23O3Br白色或淡黃色粉末，不溶于水和石油醚，微溶于乙醇、苯、乙酸乙酯等，可溶于三氯甲烷。化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 大鼠 經(jīng)口0.26 又名大隆、溴鼠隆，有二次中毒的可能 氟鼠酮 90035-08-8 C33H25O4F3灰白色或白色粉末，不溶于水，溶于乙醇、丙酮、三氯甲烷等有機(jī)溶劑。化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 大鼠 經(jīng)口0.13、46 又名殺它仗、氟鼠靈 殺鼠靈 81-81-2 C19H16O4無色透明結(jié)晶或白色粉末，不溶于水和苯，可溶于乙醇、甲醇，易溶于丙酮。遇光可變色。雄大鼠 經(jīng)口323 連續(xù)多次使用，毒性明顯增加。敵鼠 82-66-6 C23H16O3黃色粉末，微溶于水，可溶于丙酮、乙醇、苯等有機(jī)溶劑。化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 大鼠 經(jīng)口1.42.5 殺鼠醚 5836-29-3 C19H16O3黃白色純晶或粉末，難不溶于水，可溶于乙醇和丙酮等有機(jī)溶劑。150以下穩(wěn)定，暴露在陽光下或紫外光下水溶液中分解。大鼠 經(jīng)口16.5 又名立克命、殺鼠萘 附件 2 附件 2 薄層色譜法快速測定鼠藥、薄層色譜法快速測定鼠藥、毒餌毒餌中的 中14、的 香豆素類抗凝血鼠藥 香豆素類抗凝血鼠藥 1 適用范圍 1 適用范圍 本法適用鼠藥、毒餌中香豆素類鼠藥的快速定性測定，測定結(jié)果可作為初步判斷事件性質(zhì)的重要參考，可用其它分析方法進(jìn)一步確定具體鼠藥品種和含量。2 原理 2 原理 含有香豆素類鼠藥類的毒餌和鼠藥樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)點(diǎn)樣在適合的薄層板上，使用展開劑展開達(dá)到分離，經(jīng)紫外燈照射或顯色劑染色確定其Rf值，據(jù)被測物值與標(biāo)準(zhǔn)品Rf值的比較進(jìn)行定性測定，或用薄層掃描儀對斑點(diǎn)進(jìn)行原位掃描，則可進(jìn)行定量測定。3 方法重要參數(shù) 3 方法重要參數(shù) 最低檢出范圍：2g5g。4 儀器和設(shè)備 4 儀器和設(shè)備 4.1 試劑層析缸：電吹風(fēng)；微量注射器；紫外燈。4.215、 高效薄層板：硅膠GF254或高效薄層板。5 試劑和展開劑 5 試劑和展開劑 5.1 鼠藥標(biāo)準(zhǔn)品：純度99%。5.2 展開劑：5.2.1 苯丙酮（9+1）；5.2.2 二甲苯丙酮（9+1）；5.2.3 甲醇醋酸二氯乙烷（8+2+98）；5.2.4 氯仿甲醇（97+3）；5.2.5 環(huán)已烷丙酮醋酸（7+2.5+0.5）；5.2.6 二氯甲烷甲醇冰醋酸(90+8+2)。76 操作方法 6 操作方法 6.1 樣品提取：稱2g粉碎過篩(40目)的毒餌樣品(根據(jù)樣品中鼠藥含量，確定樣品量)，置于50ml離心管中。用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH值至34，加lOml甲醇,在混懸器上提取5min，離心lOmin(30016、Orpm)，將上清液移入25ml容量瓶中定容，待測。6.2 點(diǎn)樣:在薄層下端lcm基線上，用微量注射器點(diǎn)lOl樣品制備液，然后根據(jù)樣品的濃度決定標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量，一般為10l。在同一塊板上同時(shí)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，空白和樣品。6.3 顯色:將點(diǎn)樣后的薄層板放入預(yù)先盛有展開劑并已達(dá)到飽和狀態(tài)的層析缸內(nèi)。待溶劑展至約8cm以上時(shí)，取出吹干或自然揮干。在紫外燈下,觀看被測物的斑點(diǎn)呈現(xiàn)明顯的紫藍(lán)色熒光。展開劑為酸性時(shí)，斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度較弱，如于薄層板上噴10%的氫氧化鉀溶液或?qū)⒈影逯糜诎彼靠谘蹋商岣邿晒鈴?qiáng)度。定位也可采用化學(xué)顯色劑，如22%（W/V）三氯化銻氯仿溶液、8%（W/V）氫氧化鈉乙醇溶液、5%（W/17、V）硫酸乙醇溶液等。7 定性及定量方法 7 定性及定量方法 根據(jù)樣品所呈現(xiàn)斑點(diǎn)的Rf值作定性測定。若在紫外燈下定位后，用薄層掃描儀對斑點(diǎn)進(jìn)行原位掃描，則可進(jìn)行定量測定。8附件 3附件 3 薄層色譜法快速測定薄層色譜法快速測定毒餌毒餌中 中 茚滿二酮類抗凝血鼠藥 茚滿二酮類抗凝血鼠藥 1 適用范圍 1 適用范圍 本法適用于毒餌中茚滿二酮類鼠藥的快速定性測定，測定結(jié)果可作為初步判斷事件性質(zhì)的重要參考，可用其它分析方法進(jìn)一步確定具體鼠藥品種和含量。2 原理 2 原理 含有茚滿二酮類鼠藥類的毒餌和鼠藥樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)點(diǎn)樣在適合的薄層板上，經(jīng)展開劑展開達(dá)到分離，經(jīng)紫外燈照射或顯色劑顯色確定其Rf值，據(jù)被18、測物值與標(biāo)準(zhǔn)品Rf值的比較進(jìn)行定性或定量測定，或用薄層掃描儀對斑點(diǎn)進(jìn)行原位掃描，則可進(jìn)行定量測定。3 方法重要參數(shù) 3 方法重要參數(shù) 最低檢出范圍：2g5g。4 儀器和設(shè)備 4 儀器和設(shè)備 4.1 試劑層析缸:電吹風(fēng)；微量注射器；紫外燈。4.2 高效薄層板硅膠GF254或高效薄層板。5 試劑吸附劑。5 試劑吸附劑。5.1 展開劑：甲醇苯-甲酸（89+10+1）；二氯乙烷甲醇-氨水（79+20+1）。5.2 鼠藥標(biāo)準(zhǔn)：純度99%。6 操作方法 6 操作方法 6.1 樣品提取：稱2g粉碎過篩(40目)的毒餌樣品(根據(jù)樣品中鼠藥含量，確定樣品量)，置于50ml離心管中。用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5，加19、lOml甲醇，在高速混懸器上(1000Ormin)提取5min，離心lOmin，將上清 9液移入25ml容量瓶中定容，待測。6.2 點(diǎn)樣:在薄層下端lcm基線上，用微量注射器點(diǎn)lOl樣品制備液，然后根據(jù)樣品的濃度決定標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量，一般為10l。在同一塊板上同時(shí)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)、空白和樣品。6.3 顯色:將點(diǎn)樣后的薄層板放入預(yù)先盛有展開劑并已達(dá)到飽和狀態(tài)的層板缸內(nèi)。待溶劑展至約8cm以上時(shí)，取出吹干或自然揮干。在紫外燈下，觀看被測物呈黃色斑點(diǎn)。也可噴灑20%的三氯化鐵溶液或22%三氯化硒氯仿溶液進(jìn)行顯色，前者陽性斑點(diǎn)成暗紅色，后者陽性斑點(diǎn)成粉紅色。甲酸能使茚滿二酮類鼠藥斑點(diǎn)顯紅色，用含甲酸的甲醇作展開劑20、時(shí)，可見紅色斑點(diǎn)隨展開劑上移，因此不必用其他顯色劑。7 定性及定量方法 7 定性及定量方法 根據(jù)樣品所呈現(xiàn)斑點(diǎn)的Rf值作定性測定。若在紫外燈下定位后，用薄層掃描儀對斑點(diǎn)進(jìn)行原位掃描，則可進(jìn)行定量測定。10附件 4 附件 4 敵鼠鈉鹽現(xiàn)場快速定性、半定量檢測方法 敵鼠鈉鹽現(xiàn)場快速定性、半定量檢測方法（硫酸鐵試紙檢測方法）（硫酸鐵試紙檢測方法）1 適用范圍 1 適用范圍 本法適用食物（固體、半固體、液體）中毒患者嘔吐物、胃內(nèi)容物中敵鼠鈉的快速測定，可作為初步判斷事件性質(zhì)的重要參考，不能作為確定事件性質(zhì)的依據(jù)。重大突發(fā)事件性質(zhì)的判定，建議采用其他方法進(jìn)行確證。2 原理 2 原理 敵鼠鈉鹽與硫酸鐵作用21、發(fā)生反應(yīng)，生成磚紅色物質(zhì)，呈色深淺與敵鼠鈉含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)色標(biāo)比較進(jìn)行定性、半定量測定。3 方法重要參數(shù) 3 方法重要參數(shù) 最低檢出量：0.045mg/ml。4 試劑 4 試劑 4.1 5%硫酸鐵乙醇溶液。4.2 敵鼠鈉檢測試紙的制作：取定性濾紙，裁成適當(dāng)大小，將濾紙浸泡于 5%硫酸鐵乙醇溶液中，浸泡 2h 后取出，自然干燥。5 測定步驟 5 測定步驟 5.1 標(biāo)準(zhǔn)色階的制作：配制 0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L 敵鼠鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，將檢測試紙插入標(biāo)準(zhǔn)溶液中，迅速取出，即得標(biāo)準(zhǔn)色階，如長期檢測可根據(jù)實(shí)物紙片電腦制作成色標(biāo)。5.2 測定：取樣品 22、5g(ml)，加 10ml 丙酮浸漬 5min，上清液備用。將敵鼠鈉檢測試紙插入上清液中，與標(biāo)準(zhǔn)色階比較定性、半定量測定。6 結(jié)果 6 結(jié)果 陽性反應(yīng):磚紅色。陰性反應(yīng):不變色。11 附件5 附件5 高效液相色譜高效液相色譜紫外法測定血液、尿液和動物組織中 紫外法測定血液、尿液和動物組織中 香豆素類和茚滿二酮類抗凝血類鼠藥 香豆素類和茚滿二酮類抗凝血類鼠藥 1 1 適用范圍 適用范圍 本方法適用于血液、尿液和動物組織樣品中殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮?dú)埩舻亩ㄐ浴⒍繙y定。重大突發(fā)事件性質(zhì)的判定，建議采用其他方法進(jìn)行確證。2 原理 2 原理 試樣經(jīng)23、 5%乙醇/乙酸乙酯提取和（或）固相萃取小柱富集和凈化后，在 C18 反相色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離，采用紫外 310nm 波長檢測，根據(jù)色譜峰保留時(shí)間定性，標(biāo)準(zhǔn)曲線法峰面積定量。3 主要指標(biāo) 3 主要指標(biāo) 3.1定量檢出限 尿液：（0.0020.005）mg/L 血液：（0.020.05）mg/L 動物組織：（0.010.02）mg/kg 3.2 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。4 試劑與材料 4 試劑與材料 除另外說明外，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。4.1 甲醇:色譜純。4.2 乙酸乙酯:色譜純。124.3 乙酸:色譜純。4.4 乙腈:色24、譜純。4.5 OasisHLB 小柱(Waters）6ml，200mg 或其它等效產(chǎn)品。4.6 鼠藥標(biāo)準(zhǔn)：殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈與溴鼠靈（含量95%）。4.7 鼠藥標(biāo)準(zhǔn)溶液 4.7.1 鼠藥混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1.0mg/ml）分別準(zhǔn)確稱取 10.0mg 殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈與溴鼠靈標(biāo)準(zhǔn)于 10ml 容量瓶中，用少量甲醇溶解后，并用甲醇定容至刻度。4.7.2 鼠藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確吸取一定體積的殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈與溴鼠靈的標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1.0mg/ml）于 10ml 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。4.7.3 乙酸/乙酸銨緩沖溶液（5mmol/L,pH=4）的配制25、 稱取乙酸銨 0.385g 于 100ml 的燒杯中，用少量水溶解后，用純水稀至 1L，并用 1%乙酸調(diào)節(jié) pH 值至 4。5 儀器 5 儀器 5.1 高效液相色譜儀，配有紫外檢測器。5.2 分析天平：感量 0.1mg 和 0.01g 各一臺。5.3 旋渦混合儀。5.4 超聲波清洗器。5.5 全玻璃溶劑過濾器。5.6氮?dú)獯蹈蓛x。5.7 勻質(zhì)機(jī)。5.8 離心機(jī)。5.9 固相萃取裝置。5.10 微量移液器（20l、100l 和 1000l）。136 測定步驟 6 測定步驟 6.1 提取與凈化 6.1.1 全血（血漿、血清）樣品的提取與凈化 用微量移液器吸取全血（血漿、血清）1.0ml 于 5ml 26、具塞聚丙烯離心管中，加入 5%乙醇/乙酸乙酯 1.0ml 于旋渦混合儀上混合 5min，以8000r/min 離心 5min，吸取上清液于另一離心管中，再用 5%乙醇/乙酸乙酯 1.0ml 重復(fù)液-液萃取，合并有機(jī)相，用氮吹儀濃縮至干，加入甲醇/水（40:60，V/V）2.0ml 于超聲波清洗器中超聲 2min，再旋渦混合2min，然后全量轉(zhuǎn)入已活化過的 Oasis HLB 小柱（預(yù)先以甲醇 2.0ml和水 2.0ml 活化），相繼用 20g/L 乙酸/甲醇溶液（75:25,V/V）1.0ml和 20g/L 氨水/甲醇溶液（75:25,V/V）1.0 ml 淋洗雜質(zhì)，然后用體積分?jǐn)?shù)為 90%的27、甲醇水溶液 2.0ml 洗脫待測物，洗脫速度控制在0.5ml/min 以下。收集洗脫液，在 40水浴上用氮吹儀濃縮至干，殘?jiān)?250l 甲醇溶解，渦旋混合，取樣 10.0l，注入高效液相色譜儀分析測定。6.1.2 尿液樣品的提取與凈化 吸取尿液 10.0ml 于 100ml 燒杯中，以 0.10mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)尿液 pH值至 4，使其慢速通過已活化的 HLB 小柱，余下操作同 6.1.1。6.1.3 動物組織樣品的提取與凈化 稱取搗碎勻漿的動物組織樣品 2.0g 于 10ml 聚丙烯離心管中，加入5%乙醇/乙酸乙酯 5.0ml，然后用勻質(zhì)機(jī)勻質(zhì) 2min，離心分離，上清液轉(zhuǎn)移至另一個 128、0ml 聚丙烯離心管后，重復(fù)用 5%乙醇/乙酸乙酯 5.0ml提取動物組織樣品 1 次，合并有機(jī)相，用氮吹儀揮干，加入純水 5.0ml后于超聲波清洗器中超聲 2min，然后用 0.10mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)溶液 pH 值 至 4，全量轉(zhuǎn)入已活化的 HLB 小柱，余下操作同 6.2 混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 14對于血液樣品，用微量移液器在 5ml 離心管中加入一定量的鼠藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用氮?dú)獯蹈珊螅尤虢】等丝瞻籽獦?1.0ml，旋渦混勻，配制成相當(dāng)于濃度為 0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.0mg/L 和 5.0mg/L 的各鼠藥血液加標(biāo)樣品系列，余29、下操作同 6.1.1。對于尿液樣品，用微量移液器在 10ml 容量瓶中加入一定量的鼠藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)用健康人空白尿液稀至刻度，混勻，配制成相當(dāng)于濃度為 0.005mg/L、0.010mg/L、0.050mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L和 1.0mg/L 的各鼠藥尿液加標(biāo)樣品系列，余下操作同 6.1.2。對于動物組織樣品，用微量移液器在 10ml 離心管中加入一定量的鼠藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用氮?dú)獯蹈珊螅尤胍褤v碎的動物組織空白樣品2.0g，混勻，配制成相當(dāng)于濃度為 0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg 和 10.0mg/kg 30、的各鼠藥動物組織加標(biāo)樣品系列，余下操作同 6.1.3。混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。6.3 高效液相色譜-紫外法（HPLC-UV）分析 6.3.1 色譜條件 紫外檢測波長：310nm；其它同 6.3.1。6.3.2 定量測定 按照外標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算。6.4 平行試驗(yàn) 按照以上步驟對同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測定。6.5 空白試驗(yàn) 除不稱取試樣外，均按照以上步驟進(jìn)行。7 計(jì)算 7 計(jì)算 按外標(biāo)法計(jì)算血液、尿液和動物組織中抗凝血類鼠藥的含量。15見下式：fVVCC=11 fMVCC=11 式中：C血液和尿液中抗凝血類鼠藥的含量，mg/L；C動物組織中抗凝血類鼠藥的含量，mg/kg；C1從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出31、的血液或尿液中抗凝血類鼠藥的含量，mg/L；V1定容體積，ml；M取樣質(zhì)量，g；V取樣體積，ml；f試樣的稀釋倍數(shù)；計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。8.紫外分離色譜圖 8.紫外分離色譜圖 抗凝血類鼠藥的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的典型UV色譜圖 注：.1:殺鼠迷;2:殺鼠酮;3:殺鼠靈;4:氯殺鼠靈;5:敵鼠;6:氯敵鼠;7:鼠得克;8:溴敵隆;9:溴敵隆異構(gòu)體;10:氟鼠靈;11:溴鼠靈;12:噻鼠酮.16附錄6 附錄6 高效液相色譜高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血液、尿液和動物組織中 串聯(lián)質(zhì)譜法測定血液、尿液和動物組織中 香豆素類和茚滿二酮類抗凝血類鼠藥 香豆素類和茚滿二酮類抗凝血類鼠藥 1 適用范圍 32、1 適用范圍 本方法適用于血液、尿液和動物組織樣品中殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮?dú)埩舻亩ㄐ浴⒍浚ù_證）測定。2 原理 2 原理 試樣經(jīng) 5%乙醇/乙酸乙酯提取和（或）固相萃取小柱富集和凈化后，在 C18 反相色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行檢測。3 主要指標(biāo) 3 主要指標(biāo) 3.1定量檢出限 尿液：（0.010.03）ng/ml 血液：（0.10.3）ng/ml 動物組織：（0.050.2）ng/g 3.2 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。4 試劑與材料 433、 試劑與材料 除另有說明外，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。4.1 甲醇：HPLC 級。4.2 乙酸乙酯：HPLC 級。4.3 乙酸：HPLC 級。174.4 乙腈：HPLC 級。4.5 無水乙醇：HPLC 級。4.6 Oasis HLB 小柱(Waters）6ml，200mg 或其它等效產(chǎn)品。4.7 鹽酸：優(yōu)質(zhì)純。4.8 乙酸銨：優(yōu)質(zhì)純。4.9 鼠藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：殺鼠靈、氯殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮（純度95%）。4.10 鼠藥標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液 殺鼠靈、氯殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠及、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液34、（1.0mg/ml）：分別稱取殺鼠靈、氯殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮標(biāo)準(zhǔn) 10.0mg 于 11 個 10ml 容量瓶中，用少量甲醇溶解后，并用甲醇定容至刻度。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液避光 4保存，可使用 1 個月。4.11 鼠藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 分別吸取一定體積的殺鼠靈、氯殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1.0mg/ml）于 10ml 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。4.12 乙酸/乙酸銨緩沖溶液（5mmol/L,pH=4）的配制 稱取乙酸銨 0.385g 于 100ml 的燒杯中，用少量水溶解后，35、用純水稀至 1L，并用 1%乙酸調(diào)節(jié) pH 值至 4。5 儀器 5 儀器 5.1 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。5.2 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源（ESI）。5.3 分析天平：感量 0.1mg 和 0.01g 各一臺。5.4 旋渦混合儀。185.5 超聲波清洗器。5.6 全玻璃溶劑過濾器。5.7 氮吹儀。5.8 勻質(zhì)機(jī)。5.9 離心機(jī)。5.10 固相萃取裝置。5.11 微量移液器（20l、100l 和 1000l）。6 測定 6 測定 6.1 提取與凈化 6.1.1 全血（血漿、血清）樣品的提取與凈化 用微量移液器吸取全血（血漿、血清）1.0ml于5ml具塞聚丙烯離心管中，加入5%乙醇36、/乙酸乙酯1.0ml于旋渦混合儀上混合5min，以8000r/min離心5min，吸取上清液于另一離心管中，再用5%乙醇/乙酸乙酯1.0ml重復(fù)液-液萃取，合并有機(jī)相，用氮吹儀濃縮至干，加入甲醇/水（40:60，V/V）2.0ml于超聲波清洗器中超聲2min，再旋渦混合2min，然后全量轉(zhuǎn)入已活化過的Oasis HLB小柱（預(yù)先以甲醇2.0ml和水2.0ml活化），相繼用20g/L乙酸/甲醇溶液（75:25,V/V）1.0ml和20g/L氨水/甲醇溶液（75:25,V/V）1.0 ml淋洗雜質(zhì)，然后用體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇水溶液2.0ml洗脫待測物，洗脫速度控制在0.5ml/min以下。收集洗37、脫液，在40水浴上用氮吹儀濃縮至干，殘?jiān)?50l甲醇溶解，渦旋混合，取樣10.0l，注入高效液相色譜儀分析測定。6.1.2 尿液樣品的提取與凈化 吸取尿液10.0ml于100ml燒杯中，以0.10mol/L鹽酸調(diào)節(jié)尿液pH值至4，使其慢速通過已活化的HLB小柱，余下操作同6.1.1。6.1.3 動物組織樣品的提取與凈化 19稱取搗碎勻漿的動物組織樣品2.0g于10ml聚丙烯離心管中，加入5%乙醇/乙酸乙酯5.0ml，然后用勻質(zhì)機(jī)勻質(zhì)2min，離心分離，上清液轉(zhuǎn)移至另一個10ml聚丙烯離心管后，重復(fù)用5%乙醇/乙酸乙酯5.0ml提取動物組織樣品1次，合并有機(jī)相，用氮吹儀揮干，加入純水5.0ml38、后于超聲波清洗器中超聲2min，然后用0.10mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH 至4，全量轉(zhuǎn)入已活化的 HLB小柱，余下操作同6.1.1。6.2 混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 對于血液樣品，用微量移液器在 5ml 離心管中加入一定量的鼠藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用氮?dú)獯蹈珊螅尤虢】等丝瞻籽獦?1.0ml，旋渦混勻，配制成相當(dāng)于濃度為 0.1ng/ml、0.5ng/ml、2.5ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml 和 100.0ng/ml 的各鼠藥血液加標(biāo)樣品系列，余下操作同6.1.1。對于尿液樣品，用微量移液器在 10ml 容量瓶中加入一定量的鼠藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)用健康人空白尿液稀至刻度，混勻39、，配制成相當(dāng)于濃度為 0.01ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、1.0ng/ml、5.0ng/ml和 10.0ng/ml 的各鼠藥尿液加標(biāo)樣品系列，余下操作同 6.1.2。對于動物組織樣品，用微量移液器在 10ml 離心管中加入一定量的鼠藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用氮吹儀吹干后，加入已搗碎的動物組織空白樣品 2.0g，混勻，配制成相當(dāng)于濃度為 0.05ng/g、0.25ng/g、1.0ng/g、2.5ng/g、5.0ng/g 和 10.0ng/g 的各鼠藥動物組織加標(biāo)樣品系列，余下操作同 6.1.3。混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。6.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS40、）分析 6.3.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX XDB C18柱（15 mm 2.1mm i.d.,5m）或相當(dāng)者；20流動相：（A）甲醇，（B）乙酸/乙酸銨緩沖溶液（5mmol/L,pH=4），梯度洗脫：05min,60%A;510min,60%A 80%A;1015min,80%A；流速：0.4ml/min；柱溫：35；進(jìn)樣體積：20.0l。6.3.2 串聯(lián)質(zhì)譜條件 參見附錄 A、B。6.3.3 定性測定 按上述條件測定樣品和混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液時(shí)，如果樣品的色譜保留時(shí)間與混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一致，定性離子對的相對豐度與濃度相當(dāng)?shù)幕旌匣|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對豐度基本一致，則可判斷樣品中存41、在相應(yīng)的被測物。抗凝血類鼠藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖參見附錄B，混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的MRM色譜圖參見附錄C。6.3.4 定量測定 按照外標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算。6.4 平行試驗(yàn) 按照以上步驟對同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測定。6.5 空白試驗(yàn) 除不稱取試樣外，均按照以上步驟進(jìn)行。7 計(jì)算 7 計(jì)算 按外標(biāo)法計(jì)算血液、尿液和動物組織中抗凝血類鼠藥的含量。見下式：fVVCC=11 fMVCC=11 21式中：C血液和尿液中抗凝血類鼠藥的含量，ng/ml；C動物組織中抗凝血類鼠藥的含量，ng/g；C1從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出的血液或尿液中抗凝血類鼠藥的含量，ng/ml；V1定容體積，ml；M42、取樣質(zhì)量，g；V取樣體積，ml；f試樣的稀釋倍數(shù)；計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。22附錄 A 串聯(lián)質(zhì)譜條件離子源：大氣壓電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；掃描范圍（m/z）：50600；毛細(xì)管電壓：2700V；毛細(xì)管出口電壓：-205V；干燥溫度：350；干燥氣流速：9.0L/min；噴霧器壓力：35.0psi；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），監(jiān)測條件見表 A.1。表 A.1、待測物的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)條件 化合物 母離子(m/z)定量離子(m/z)確證離子(m/z)峰寬(m/z)源內(nèi)碰撞解離電壓(V)殺鼠靈 307 161 250,117 2.0 0.95 氯殺鼠靈 341 161 28443、,117 2.0 1.00 殺鼠迷 291 247 219,1872.0 0.90 溴敵隆 527 465 491,3892.0 1.50 氟鼠靈 541 382 289,1612.0 1.50 溴鼠靈 523 477 373,2192.0 1.50 鼠得克 443 293 161,143 2.0 1.10 敵鼠 339 167 145,172 2.0 1.25 氯敵鼠 373 201 145,172 2.0 1.05 殺鼠酮 229 172 145,214 2.0 0.90 噻鼠酮 537 151 203,371 2.0 0.95 所列參數(shù)是在Agilent 1100 series LC/M44、SD Trap SL型質(zhì)譜儀上完成的，此處列出試驗(yàn)用儀器型號僅是為了提供參考，并不涉及商業(yè)目的，鼓勵標(biāo)準(zhǔn)使用者嘗試采用不同廠家或型號的儀器。23附錄 B 附錄 B 抗凝血類鼠藥的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜圖 抗凝血類鼠藥的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜圖 24 a殺鼠靈；b氯殺鼠靈；c殺鼠迷；d溴敵隆，e氟鼠靈；f溴鼠靈；g鼠得克；h敵鼠，i氯敵鼠；j殺鼠酮；k噻鼠酮 圖B1、抗凝血類鼠藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液一級質(zhì)譜圖.圖B1、抗凝血類鼠藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液一級質(zhì)譜圖.25 26 a殺鼠靈；b氯殺鼠靈；c殺鼠迷；d溴敵隆，e氟鼠靈；f溴鼠靈；g鼠得克；h敵鼠，i氯敵鼠；j殺鼠酮；k噻鼠酮 圖 B 2、抗凝血類鼠藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液二級質(zhì)譜45、圖 27附錄 C 抗凝血類鼠藥的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的 MRM 色譜圖 28 a殺鼠靈；b氯殺鼠靈；c殺鼠迷；d溴敵隆，e氟鼠靈；f溴鼠靈；g鼠得克；h敵鼠，i氯敵鼠；j殺鼠酮；k噻鼠酮 注:在選定條件下,殺鼠迷、殺鼠酮、殺鼠靈、氯殺鼠靈、敵鼠、氯敵鼠、鼠得克、溴敵隆、溴敵隆異構(gòu)體、氟鼠靈、溴鼠靈和噻鼠酮的保留時(shí)間分別為2.78,4.15,4.42,6.11,7.72,9.08,10.45,11.42,12.11,13.08,14.05和14.86min.圖 C.抗凝血類鼠藥的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的 MRM 色譜圖 29附錄 C 抗凝血類鼠藥的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的 MRM 色譜圖 30 a殺鼠靈；b氯殺鼠靈；c殺鼠迷；d溴敵隆，e氟鼠靈；f溴鼠靈；g鼠得克；h敵鼠，i氯敵鼠；j殺鼠酮；k噻鼠酮 注:在選定條件下,殺鼠迷、殺鼠酮、殺鼠靈、氯殺鼠靈、敵鼠、氯敵鼠、鼠得克、溴敵隆、溴敵隆異構(gòu)體、氟鼠靈、溴鼠靈和噻鼠酮的保留時(shí)間分別為2.78,4.15,4.42,6.11,7.72,9.08,10.45,11.42,12.11,13.08,14.05和14.86min.圖 C.抗凝血類鼠藥的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的 MRM 色譜圖 31